BRCA和PARP
一九八一年的愚人節，對於Mary-Clare King來說是其一生難忘的時刻。她以為是玩笑，但確是真實的事情，她的丈夫帶著新歡離她而去。這個沉重的打擊令她無法自拔，幾乎難以站到伯克利的大學講台上繼續講課。下班後，她被系主任叫進辦公室，告訴她“你已經被授予終身教職資格（Tenure）”。 還沒來得及高興，到家開門之後才發，盜賊剛剛光顧了這裡，家裡被洗劫一空。一天之內經歷的這些，過山車一樣的事情，令她都幾乎安排去華盛頓特區的行程。她本來申請了國立衛生研究院NIH的資金申請，進行科研計畫。家人在關鍵時刻站出來支持她，終於按計劃成行。NIH的面試非常成功，她如願以償的得到了這筆金額很大的項目，可以開始計劃許久的研究工作，從此開啟了傳奇的BRCA的故事。
Mary-Clare King於1946年出生於美國伊利諾伊州芝加哥，本科就讀於明尼蘇達州的Carleton大學，並對數學研究很有興趣。在加州大學伯克利分校研究生期間，選擇了遺傳學，作為終生從事的職業方向。1972年獲得博士學位之後，在從事正式的工作之前，在一位朋友的實驗室作為過渡期，她參與了一個課題，來研究乳腺癌的家族性。
這是一個全新的角度，在此之前，學界一般認為病毒是導致癌症的主要原因。而她認為，乳腺癌至少有一部分是遺傳的。在大學期間的統計學知識幫助了她，而一個機緣巧合的機會，則是美國國家癌症研究所NCI正對1500乳腺癌女性進行調查，Mary-Clare King懇請在問卷上增加一個問題：病人家屬是否有乳腺癌或者卵巢癌？
機會總是留給有準備的人。根據調查數據，她發現乳腺癌的確有明顯的家族性，證明了她的假設。進一步估算，某些基因突變導致的乳腺癌患者佔全部乳腺癌的4%，攜帶這個基因的女性，在70歲之前有82%的概率患乳腺癌，相比之下，沒有攜帶突變的女性只有8%的概率患癌。雖然這個導致乳腺癌的基因的確可能存在，那麼這個基因是什麼，在染色體上哪一部分？
從1974年開始，她開始探索這個乳腺癌基因。直到1990年，她的課題組成功將乳腺癌基因定位與人類基因組的第17號染色體，這個基因，也有了一個名字，就是乳腺癌基因一號（BRCA1）。這個研究結果於1990年發表在《Science》上，之後不久，另外一組學者也用相同的方法，在另外一組患者中做出了相同的發現，佐證了她的發現。
這可是一項劃時代的成功，因為在當時，定位克隆技術已經開始通用，這意味著可以對基因進行測序，找到克服乳腺癌的金鑰匙。定位克隆技術比較原始但也簡單粗暴，能夠順藤摸瓜順著染色體去找，最後找到目標基因。笨方法但是只要支持以恆，就能找到目標。美國商人敏銳的眼光也投向了這一領域。當時沒有互聯網，沒有大規模測序儀，這些都不影響精力和資本的投入。
現在我們知道，不同於其他相對簡短的基因，BRCA可是有5000多個突變的長序列基因，總長度超過100kb，包含23個外顯子，轉錄本長度4.4kb，產生的蛋白有1863個氨基酸，其中突變位點也有1785個。所以難度可想而知。後來的事情則令人意外，Mark Skolnick 在鹽湖城成立了Myriad公司，在資本力量的推動下首先成功克隆了BRCA1基因，1994年發表在首屈一指的《Science》上。Mary-Clare King距離更大的成功之有一步之遙。
雖有遺憾，但是Mary-Clare King仍是BRCA基因的第一個發現者，這個成就是不能磨滅的，2014年度，她獲得了被譽為美國諾貝爾獎的拉斯克獎，2016年，美國總統奧巴馬親自授與她美國國家科學家獎章。
後面的故事還有一個插曲，Myriad公司對BRCA基因申請了專利保護，令到Mary-Clare King和一眾科學家對這一基因的研究都受到限制！而通常，遺傳領域的專利並不限制科學研究活動。直到2013年，美國最高法院以9比0通過決議終止了這一專利保護，各國科學家可以繼續研究這一重要基因。
萬事開頭難，接下來的事情，就順利的多了。緊跟著BRCA1基因，1995年還是Myriad公司成功克隆了BRCA2基因，1995年發表在首屈一指的《Nature》上。說到這裡，可以說BRCA的故事開了一個好頭。科學家繼續將這個故事講下去。
根據癌基因假說，腫瘤是由於癌基因和抑癌基因的共同作用所產生的。第一個被鑑別出來的抑癌基因是Rb基因。當時科學家已經對抑癌基因的作用有了一定了解。後來對BRCA的研究，證實也是一個抑癌基因。
既然BRCA基因是在人類染色體上找到的，說明它是本身就存在的。正常情況下，也就是BRCA之中沒有產生壞份子的情況下，它是保護人類細胞的。我們知道身體的細胞每天都接受各種外在的刺激，例如紫外線或者霧霾，甚至有些有毒的化學物質等等，這些因素對細胞的分裂帶來影響，導致正常細胞的DNA複製產生錯誤，這個時候會出現DNA雙鍊斷裂，簡單來說，就像書本裡的文字換行了，產生病句，語意不通。這個時候就靠BRCA出來工作了，它負責校對或者審稿，修復斷裂的DNA，這個過程非常重要，但是直到2005年，Bartkova和Gorgoulis的工作才解開了這個謎底，他們分別在小鼠身上證明BRCA具體的修復機制；也正是這一機制，BRCA行使修復作用，使正常的細胞分裂繼續下去。這也是為什麼人體能夠抵禦外來刺激而不產生腫瘤細胞的原因之一。如果BRCA基因出了問題，將導致細胞分裂失敗，好的細胞將逐步變成壞的細胞，即發生癌變。這個發現在2005年發表在《Nature》上。結合Mary-Clare King的工作，當時她發現了在遺傳性乳腺癌患者中存在的基因，就是這個突變的BRCA基因。
人類的細胞內有染色體，是兩股DNA序列按規律配對的，所有基因，都包含在每一股DNA上，這個兩股DNA，一個來自父本，一個來自母本。假如母本的DNA中已經有了BRCA基因的突變，那麼子女身體的細胞內都會有這個突變的BRCA基因，這個就是胚係突變。
另一種情況是，只有在腫瘤細胞中才有BRCA突變，是後天產生的，這是體細胞突變。
前面提到，這個基因出現問題，那麼功能就受損，帶來的後果是正常人體細胞的複製出現問題，一步一步的導致癌的發生。當然，這個逐步的過程，還要受到其他因素的影響，而因癌變可能是一個長達數年或數十年的過程。前面Mary-Clare King估算攜帶這個基因的女性，在70歲之前有82%的概率患乳腺癌，相比之下，沒有攜帶突變的女性只有8%的概率患癌。來自NIH的數據顯示，攜帶BRCA突變的的女性，70歲時乳腺癌的累計發病風險是87%，是普通人群的7倍以上，卵巢癌的發病風險是63%，是普通人的30倍。2013年那個明星茱莉的事情大家都知道了，她的母親（56歲）和姨媽（61歲）都死於乳腺癌，而她本人在Myriad公司進行檢測，發現是BRCA攜帶者，2015年，她決定切除卵巢和輸卵管，以降低發生卵巢癌的風險。她在紐約時報發文說並非僅僅由於攜帶這個基因令她下決心進行手術，而實際上查出BRCA突變也不需媽說手術，她希望所有女性都了解這一點。不過當時的確有不少人跟著她這樣做了。至於她們現在情況怎樣，有沒有患癌，且了卵巢，那麼乳腺情況怎樣呢，現在沒有見到報導。
茱莉是健康者，類似她這樣的情況，即健康者的BRCA檢測問題，目前有了專家共識，BRCA1/2 突變健康攜帶者應在充分的知情同意和遺傳咨詢後，根據年齡和生育情況，選擇合適的藥物或手術干預方式。
前面提到的了BRCA基因的功能，以及在正常人群中的意義。那麼對於已經確診癌症的患者來說，有什麼意義呢？
再回到BRCA的功能上來，我們知道其功能是上面提到的細胞分裂是DNA損傷修復相關。展開來說一點生物學的東西。在生命活動過程中，細胞內基因組 DNA 經常受到多種體內因素和體外環境因素的影響而導致 DNA 損傷， 這種 DNA 損傷可影響基因的正常表達並導致基因突變，正常DNA是由ATCG四種鹼基排列的，突變就是A變成G等等，既然DNA最終要合成蛋白質構成人體，那麼鹼基順序錯了，合成的蛋白質就可能出問題了，這時候會影響細胞的正常生理功能，產生疾病了，包括腫瘤。
根據 DNA 損傷的類型，可以大致分為鹼基損傷、DNA 交聯、 DNA 單鏈斷裂(single-strand breaks，SSBs)、DNA 雙鏈斷裂 (double-strand breaks，DSBs) 和鹼基錯配等。那這不是很危險？！其實不要緊，在長期的進化過程中，細胞已經形成和發展了多種修復機制來維護基因組的穩定性，包括直接修復、 鹼基切除修復、核苷酸切除修復、DNA 單鏈斷裂修復(DNA single-strand breaks repair，SSBR)、DNA 雙鏈斷裂修復(DNA double-strand breaks repair，DSBR)和 MMR 系統等。MMR系統包括MSH2，MSH6，MLH1和PMS2，等等，這不是很眼熟嗎，檢測免疫治療的時候用的？對，免疫治療的事情以後再說。DNA 單鏈斷裂修復SSB是最常見的也是最危險的，因為可以導致一系列的遺傳改變，包括 DNA 缺失、雜合性缺失(lossofheterozygosity，LOH)、染色體易位和丟失等，出現這種情況，裡細胞癌變也就不遠了。現記住一點，負責修復SSB的，就是一種叫做PARP的蛋白。而單鏈斷裂修復失敗，則會進一步導致雙鏈斷裂，其實雙鏈斷裂修復DSBR也是有辦法的，主要通過兩種途徑完成，一種是非同源末端連接(NHEJ)，另一 種途徑是同源重組(homologousrecombination，HR)。同源重組是不是很眼熟，是不是每天臨床都在檢測的HRD？所以再先進的臨床，歸根到底也是來自基礎研究，來自分子生物學。
單鏈修復失敗後導致雙鍊破壞，這時候靠同源重組HR機制來修復，其實負責同源重組修復的蛋白，就是BRCA基因產生的蛋白。還記得2005年Bartkova和Gorgoulis的工作嗎？合成致死的概念從這個時候提出來的。簡單來說，PARP 蛋白是負責DNA單鏈斷裂SSB 的，如果抑制 PRAP蛋白的功能，則會導致持續的SSB積累，一旦複製叉遇到了一個單鏈斷裂 SSB， DNA損傷就會轉換成雙鏈斷裂 DSB；如果DNA 雙鏈斷裂通過通過 HR 和 NHEJ 機制修復失敗，那結果將是致命的！而 BRCA1 和 BRCA2 就是在 HR 中起到決定性作用！但在 BRCA 1/2 基因突變型癌細胞內，由於不能進行 HR 這一重要的精確途徑，從而導致癌細胞致死概率大幅提升！這不就是治療腫瘤的效果嗎？Gorgoulis說了，PARP 蛋白抑製劑對 BRCA 1和 BRCA 2 基因缺失的細胞的抑製作用分別增強了57 倍和 133 倍的敏感性！
好了，兩條路分開來說都不能單獨導致癌細胞死亡，但是將兩條路都管住了，就能導致癌細胞死亡，這就是合成致死的通俗概念。管住其中一條路，需要管住PARP的功能；管住另外一條通路，靠的是檢測BRCA突變。從這個思路出發，科學家開發出來了能管住PARP蛋白功能的東西，叫做PARP抑製劑；也開發了BRCA突變的檢測這一有用的工具。通過檢測BRCA，如果發現有BRCA胚係或者體細胞突變，等於已經管住了一條路，再加上PARP抑製劑，就等於抑制住兩條路，癌細胞就合成致死了，達到所需要臨床目的。換一種說法，BRCA1/2突變或者HRD的癌細胞，依靠PARP功能來生存，給這樣的癌細胞用PARP抑製劑，癌細胞就會凋亡，達到治療目的。這和傳統的信號通路抑製劑不同，EGFR突變就用EGFR抑製劑；在這裡，臨床檢測的是BRCA或者HRD，但是響應的藥物卻不是BRCA或HRD抑製劑，臨床應用的而是PARP抑製劑。
到這裡為止，從BRCA基因開始，說到了PARP抑製劑，都是目前臨床上的熱點內容，特別是PARP抑製劑，從晚期腫瘤的應用，已經到了早期腫瘤術後的輔助治療，可謂是攻城掠地，不斷進取。既然前面把它說的那麼好，理論上它的效果應該是非常高的，但實際上也沒有達到100%，其實有效率也不過50-60%。什麼原因呢？
前面說了，要用好藥物，不能光靠臨床指南，還要靠醫生的經驗。但是醫生不去思考，來一個用一個，那估計也沒有很多成功的經驗。還要靠思考。
回到原理上來，PARP抑製劑靠的是合成致死的機制，也就是DNA修復失敗。前提是，細胞需要在不停的複製和分裂過程中。如果沒有這些過程，那麼這個藥就是沒效的。複製和分裂約活躍，有效率越高。哪些情況下比較活躍？就是用了化療藥物之後，特別是鉑類藥物，順鉑和卡鉑。
當初PARP抑製劑在鏡湖醫院上市使用的時候，我和藥物公司醫學部的同事交流作用機制，談到這個藥物的機制，是否對癌變過程的細胞才有效？當時的確搞混了幾個概念。癌變過程的確有DNA複製，但是過程很長，不可能在患者個體中觀察到。但是患者個體中，癌細胞是在不斷分裂的，表現為腫塊增大，在這個過程中是存在DNA複製，也就是存在PARP抑製劑的作用前提條件。從臨床實驗的數據來看，無論是順鉑有效的患者，這些患者癌細胞經過順鉑的作用，引起肿瘤细胞 DNA 损伤，在此基礎上，用上PARP抑製劑療效較好。
PARP抑製劑的耐藥問題是臨床的主要困擾之一。由於癌細胞通過選擇壓力，耐藥克隆株的演化等原因，來逐漸適應藥物的殺傷作用。不同於癌變過程的緩慢，這個過程可能是在短短數月內發生的，臨床表現是腫瘤病灶再次增大，或者出現轉移。科學家總結出來的原因，包括癌細胞逆轉了HRD表型，或者讓BRCA在產生新的突變，也就是不再依賴HR來修復DNA損傷了；另外就是增加藥物外排，將藥物排出細胞外；穩定DNA複製衩，總之，讓PARP抑製劑無用武之地。
魔高一尺道高一丈，科學家還是在不斷探索新的治療手段來克服耐藥。例如，用PI3K抑製劑來克服HRD表型的改變；利用組蛋白抑製劑(vorinostat)來克服對細胞週期的抑制，其他手段還包括HSP90蛋白，細胞週期蛋白抑製劑調控不讓癌細胞停止在細胞週期內靜止不動等等。 科學總是在不停鑽研。
癌細胞表現的多樣性或者異質性，給患者治療帶來困難，臨床醫生當然希望用對藥物： 給合適的患者用合適的藥物。患者有什麼合適和不合適之分？無非就是毫無辦法的說辭而已。只能是嘗試而已，用既往對其他患者有效的因素，來指導眼前患者的治療。鉑類藥物化療有效的患者對PARP抑製劑有效率較高，這是一個指標，但是只在卵巢癌患者中有用，而在乳腺癌中並無預測作用。近期發現，更加有效的預測因素是RAD51基因。對於非HRD患者，只能用聯合免疫治療的方法來試一下了。
臨床的數據就不一一展開了，不然這會讓大家索然無味。這一類藥物是好藥，毫無疑問。自從2015年在鏡湖開始使用，當時很多國內患者前來就診，印象深刻的是一位上海的患者家屬，給他太太購買Olaparib。療效還在其次，這個家屬加我微信方便聯繫，他樂觀的態度的確感染了我。